Cell Rep︱宋建人课题组揭示脊髓损伤后脊髓环路重建的新规律

撰文︱黄春筱，关   娜，王   祯

责编︱王思珍，方以一

编辑︱夏   叶

节律性躯体运动的产生是基于大脑将运动命令传递到脊髓中枢模式产生器（Central pattern generator，CPG）[1]。脊髓受损后，脊髓CPG环路的中间神经元轴突严重受损，导致运动能力丧失。如何通过修复执行躯体运动的脊髓CPG环路，进而恢复脊髓损伤后运动能力是重要的研究思路。而脊髓CPG环路在脊髓损伤后的重建规律和修复机制却鲜有报道。研究表明，哺乳动物和斑马鱼脊髓损伤模型中，动物体在一定程度上会自主恢复运动能力，很大程度依赖于脊髓固有中间神经元轴突再生[2,3]。脊髓CPG中有一类对运动产生至关重要的谷氨酸能中间神经元：V2a中间神经元[4]，它可以接受大脑传递的运动命令并将命令传给运动神经元，控制脊髓躯体运动的产生[5]。因此探究脊髓损伤后V2a中间神经元轴突再生及其参与环路重建的机制，是研究脊髓损伤后运动功能恢复机制的关键。

2022年10月25日，同济大学宋建人团队在Cell Reports杂志上以题目“De novo establishment of circuit modules restores locomotion after spinal cord injury in adult zebrafish”发表了研究论文。同济大学助理研究员黄春筱老师和博士生王祯为论文共同第一作者，同济大学宋建人教授和关娜副教授为论文共同通讯作者。该研究系统地解析了脊髓损伤后快速V2a中间神经元轴突先再生并参与构成执行快速运动的神经环路，慢速V2a中间神经元轴突后再生并参与形成执行慢速运动的神经环路，揭示了损伤后脊髓内V2a中间神经元轴突的再生规律。脊髓损伤后神经环路重建规律与发育模式相似，并最终决定了运动功能的逐步恢复。（拓展阅读：宋建人团队最新进展，详见“逻辑神经科学”报道：Nature Comm︱宋建人课题组发现脊髓损伤后促进神经环路重建的新靶点）

研究者利用斑马鱼中枢神经系统再生能力强的优势，建立了成年斑马鱼脊髓损伤模型（图1A）。发现脊髓组织在损伤后8周时基本完全愈合（图1B）。行为学分析发现损伤后8周时斑马鱼运动能力基本恢复到正常水平（图1E-F）。为了探究脊髓损伤后脊髓内部的V2a中间神经元轴突是否可以再生穿过损伤处。研究者在损伤处尾端加入红色荧光染料-rhodamine dextran 逆行标记轴突可再生穿过损伤处的V2a中间神经元，发现大约有30%-50%的V2a中间神经元轴突再生至损伤处尾端（图1C-D）。研究者发现轴突可再生V2a中间神经元数目与损伤后运动能力恢复呈正相关（图1G）。以上研究结果证明了脊髓损伤后V2a中间神经元轴突再生与运动能力恢复是密切正相关的。

图1 脊髓损伤后V2a中间神经元轴突再生与运动恢复呈正相关

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

为了探究轴突再生的V2a中间神经元在功能上是否存在差异。研究者在损伤后2-3，4-5，7-8周三个时间段，利用全细胞膜片钳技术对损伤处头端轴突再生的V2a中间神经元进行电生理特性记录，功能检测，形态标记和胞体空间位置分析。发现损伤后2-3 周轴突发生再生的主要为在快速游泳中被激活的快速V2a中间神经元（图2A-D），该类V2a中间神经元集中分布在dorsomedial区域（图2E）；在更慢游泳速度下被激活的慢速V2a中间神经元在损伤后4-5周至7-8周才逐步发生轴突再生（图2H-K,2O-R），此类V2a中间神经元胞体集中分布在ventrolateral区域（图2L,S）。以上研究结果证明在损伤早期快速V2a中间神经元轴突先再生穿过损伤处，随着损伤恢复时间的增加，慢速V2a中间神经元轴突再生穿过损伤处，快速和慢速V2a中间神经元共同参与到损伤后神经环路修复过程中。

图2 快速和慢速V2a中间神经元依照时间顺序发生轴突再生

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

为了研究脊髓损伤后躯体运动能力恢复所遵循的规律，研究者对脊髓损伤早期（损伤后2周）和损伤晚期（损伤后8周）斑马鱼进行游泳行为分析（图3A），发现在损伤早期斑马鱼仅恢复高频运动方式应对所有游泳速度（图3B-D,F）；损伤晚期逐步恢复更加灵活的全频运动方式应对不同的游泳速度(图3B-D,G)。以上数据证明脊髓损伤动物运动能力恢复遵循着先恢复高频运动后恢复低频运动的规律，与上述V2a中间神经元轴突再生规律相对应。

图3 脊髓损伤动物运动能力恢复遵循着先高后低节律性运动逐步恢复的原则

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

为了探究脊髓损伤后轴突再生的快速和慢速V2a中间神经元如何参与神经环路重建以介导上述运动功能的逐步恢复，研究者利用双通道全细胞膜片钳技术对损伤处头端轴突再生的V2a中间神经元与损伤处尾端的V2a中间神经元和运动神经元进行突触连接研究。发现在损伤早期轴突再生的快速V2a中间神经元与损伤处尾端快速和慢速V2a中间神经元建立同等强度突触连接（图4A-D），形成单一的快速神经环路；损伤晚期轴突再生的快速V2a中间神经元和慢速V2a中间神经元分别与损伤处尾端快速和慢速V2a中间神经元/运动神经元建立突触连接（图4I-T），构成模块化神经环路。以上结果表明模块化神经环路的有序重建支持了运动功能逐渐恢复。

图4 快速和慢速V2a中间神经元参与的模块化神经环路有序重建是运动功能逐步恢复的基础

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

为了探究脊髓损伤后调控V2a中间神经元轴突再生和环路重建的分子机制，研究者利用流式细胞分选和RNA测序的方法对轴突可再生和无法再生的V2a中间神经元进行基因差异表达分析（图5A,B）。发现与快速运动模块相关的calb2b基因在损伤后轴突可再生V2a中间神经元中显著表达 [6] （图5B,C）。利用CRISPR/Cas9技术敲除calb2b后，发现快速V2a中间神经元轴突再生受阻（图5D-G），斑马鱼快速运动能力恢复变差（图5H）。以上数据证明calb2b是调控快速V2a中间神经元轴突再生的关键基因，它的缺失会阻碍快速V2a中间神经元轴突再生能力进而阻止损伤后运动能力的恢复。

图5 敲除calb2b基因阻碍快速V2a中间神经元轴突再生和快速运动能力恢复

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

脊髓损伤后运动训练可以促进运动能力的恢复[7]，然而关于训练促进功能恢复的机制还不清楚。为了探究运动康复训练是否可以通过促进V2a中间神经元轴突再生进而促进运动神经环路的重建，研究者将损伤后2周的斑马鱼进行为期两周的训练（图6A），损伤后4周官产发现训练组轴突可再生的慢速V2a中间神经元相较对照组明显增加并达到损伤后8周水平，运动功能的恢复进程显著加速（图6B-C）。以上数据证明运动训练通过促进V2a中间神经元轴突再生，加速运动能力的恢复。

图6 运动训练促进慢速V2a中间神经元轴突再生并加速运动能力恢复

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

图7 斑马鱼脊髓损伤后V2a中间神经元参与的环路重建规律决定运动功能恢复的机制

（图源：Huang CX, et al., Cell Reports, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望在这篇研究中研究者发现，成年斑马鱼完全脊髓损伤后脊髓内V2a中间神经元轴突再生与运动功能的恢复密切相关，在脊髓损伤早期快速V2a中间神经元轴突首先再生形成单一的快速神经环路，在损伤晚期轴突后再生的慢速V2a中间神经元与快速V2a中间神经元共同构成模块化的神经环路。脊髓损伤后模块化环路的有序重建决定了运动功能的逐步恢复（图7）。此外研究者还发现敲除calb2b基因会阻碍快速V2a中间神经元轴突再生和损伤后运动能力的恢复；然而运动训练可以促进慢速V2a中间神经元的轴突再生，加速运动能力的恢复。这篇研究证明了脊髓内V2a中间神经元轴突再生和环路重建对脊髓损伤后运动能力恢复的关键作用，为未来哺乳动物脊髓损伤干预治疗提供了新的依据。未来有待于进一步在鼠等中枢神经系统再生能力差的哺乳动物模型中验证其在脊髓损伤后运动恢复过程中的作用机制。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111535

同济大学助理研究员黄春筱和同济大学博士研究生王祯为论文共同第一作者，同济大学宋建人教授和关娜副教授为本文共同通讯作者。本研究得到同济大学医学院章小清教授的指导和支持。本研究得到科技创新2030-“脑科学与类脑研究”、国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科委重大专项、上海市自然科学基金、同济大学附属上海市第四人民医院、同济大学脑与脊髓临床研究中心、同济大学医学院脑功能与人工智能转化研究所等资助。

第一作者：黄春筱（左一），王祯（左二）；通讯作者：关娜（右二），宋建人（右一）

(照片提供自：宋建人实验室)

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci 10, 507-518 (2009).

[2] Ballermann, et al. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. Eur J Neurosci 23, 1988-1996(2006).

[3] Bareyre, et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci 7, 269-277(2004).

[4] Ampatzis, K., et al. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron 83, 934-943. (2014)

[5] Dougherty, et al. Locomotor rhythm generation linked to the output of spinal shox2 excitatory interneurons. Neuron 80, 920-933(2013).

[6] Berg, E.M., et al. Complementary expression of calcium binding proteins delineates the functional organization of the locomotor network. Brain Struct Funct 223, 2181-2196(2018).

[7] Shibata, T., et al. Treadmill training based on the overload principle promotes locomotor recovery in a mouse model of chronic spinal cord injury. Exp Neurol 345, 113834 (2021).

本文完